IVD行業(yè)常見(jiàn)的核酸提取方法及原理

發(fā)布時(shí)間:05-27 | 作者: | 來(lái)源:| 5815:次圍觀

1.核酸的基礎(chǔ)知識(shí)
核酸分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）,其中RNA又可以根據(jù)功能的不同分為核糖體RNA(rRNA),信使RNA（mRNA）和轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）。
DNA主要集中在細(xì)胞核內(nèi),線粒體和葉綠體中,而RNA主要分布在細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中


核酸中因?yàn)猷堰蕢A和嘧啶堿具有共軛雙鍵,所以核酸具有紫外吸收的特性,DNA鈉鹽的紫外吸收在260nm附近,其吸光率以A260表示,在230nm處于吸收低谷,因此可以使用紫外分光光度計(jì)對(duì)核酸進(jìn)行定量及定性測(cè)定。
核酸為兩性電解質(zhì),相當(dāng)于多元酸,可以使用中性或偏堿性的緩沖液使核酸解離成陰離子,置于電場(chǎng)中向陽(yáng)極運(yùn)動(dòng),這就是電泳的原理。
2.核酸提取純化原則和要求
＞保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性
＞排除其它分子的污染（如提取DNA時(shí)排除RNA的干擾）
＞核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和高濃度的金屬離子
＞盡可能降低蛋白質(zhì)、多糖和脂類等大分子物質(zhì)

3.核酸提取純化方法
＞酚/氯仿抽提法
1956年發(fā)明,通過(guò)酚/氯仿處理細(xì)胞破碎液或者組織勻漿后,在水相中主要溶解以DNA為主的核酸成分,在有機(jī)相中主要是脂類物質(zhì),蛋白質(zhì)位于兩相之間。
＞醇沉淀法
乙醇能夠消除核酸的水化層,使帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)暴露出來(lái),NA﹢等帶正電荷離子能與磷酸基團(tuán)結(jié)合,形成沉淀。
＞層析柱法
通過(guò)特殊硅基質(zhì)吸附材料,能夠特定吸附DNA,而RNA和蛋白質(zhì)順利通過(guò),然后利用高鹽低PH結(jié)合核酸,低鹽高PH值洗脫,來(lái)分離純化核酸。

＞熱裂解堿法
堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離他們,在堿性下,變性蛋白是可溶的。
＞煮沸裂解法
加熱處理DNA溶液,利用線性DNA分子的特性,通過(guò)離心將DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片形成的沉淀分離。
＞納米磁珠法
運(yùn)用納米技術(shù)對(duì)超順磁性納米顆粒的表面進(jìn)行改良和表面修飾后,制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識(shí)別和高效結(jié)合。利用氧化硅納米微球的超順磁性,在Chaotropic鹽(鹽酸胍、異硫氰酸胍等)和外加磁場(chǎng)的作用下,從血液、動(dòng)物組織、食品、病原微生物等樣本中分離出DNA和RNA。
＞其他方法
除了上述常用的方法之外,還有超聲法、反復(fù)凍融法、酶解法及低滲裂解等等多種方法。

4.核酸提取類型
＞總RNA提取
總RNA中,75-85%為rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA),其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA,snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA,snoRNA）等組成。
＞miRNA提取
MicroRNAs (miRNAs)是小型的、高度保守的RNA分子,如小干擾RNAs (siRNAs),通過(guò)與他們的堿基配對(duì)調(diào)節(jié)其同源mRNA的分子表達(dá),以預(yù)防通過(guò)各種機(jī)制的表達(dá)。他們已成為進(jìn)行發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞周期的重點(diǎn)監(jiān)管機(jī)構(gòu)。
＞基因組DNA提取
進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究以及基因診斷,通常要求得到的片段長(zhǎng)度不小于100～200kb。在DNA提取過(guò)程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素,以保證DNA的完整性,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
＞質(zhì)粒抽提
質(zhì)粒抽提方法即去除RNA,將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組 DNA分開(kāi),去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì),以得到相對(duì)純凈的質(zhì)粒。