解析丨(2019-nCoV)核酸檢測結(jié)果假陽性假陰性的原因

發(fā)布時間:05-28 | 作者: | 來源:| 19307:次圍觀

但新型冠狀病毒感染病例如何確診以及治愈標(biāo)準(zhǔn)一直是醫(yī)學(xué)界及公眾最為關(guān)注的問題之一。

目前,有不少媒體相繼報道,核酸檢測結(jié)果連續(xù)2次為陰性（隔日檢測）即可判定治愈。但是,近日武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)生張笑春卻在朋友圈中不斷呼吁,推薦CT影像作為新型肺炎的主要診斷依據(jù),希望不要太信任核酸檢測。此外,
2月4日,美國安德森癌癥中心肺科專家、終身教授張玉蛟發(fā)布文章表示,建議盡快建立CT做為新型肺炎的確診標(biāo)準(zhǔn),提高新冠病毒檢測率。
2月5日,央視主持人白巖松在《新聞1+1》節(jié)目中,連線中國工程院副院長、呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)專家王辰,介紹武漢疫情防控的最新進(jìn)展。王辰表示,目前的檢測方式主要還是對于病毒核酸的檢測。

但新冠病毒有一個特點(diǎn),并不是所有感染的患者都能測出核酸陽性的！

因此,有大量的看著流行病學(xué)史上、接觸史上像是,臨床癥狀上也像是,但是核酸未能得到確診的患者,現(xiàn)在被列為疑診病例。

王辰建議,在疫情非常突出和嚴(yán)峻的武漢地區(qū),對于有流行病史,有典型的臨床癥狀的患者,應(yīng)當(dāng)可以列為臨床診斷病例。
因為核酸檢測即便是對確診病人,也不過只有30~50%的陽性率；也就是說,通過咽拭子這種檢測方式還是有很多假陰性的患者,即核酸沒有發(fā)現(xiàn),卻是確診病例的患者。

2月5日
《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》發(fā)布,將“疑似病例具有肺炎影像學(xué)特征者”作為湖北省臨床診斷病例標(biāo)準(zhǔn),提示湖北地區(qū)新型冠狀病毒診斷不再依賴核酸檢測結(jié)果。

這一診斷標(biāo)準(zhǔn)的改變,目前僅針對湖北地區(qū)疫情特殊情況,對于2019-nCoV的檢查,《新型冠狀病毒(2019-nCoV)感染的肺炎診療快速建議指南(標(biāo)準(zhǔn)版)》強(qiáng)烈推薦對于疑似患者進(jìn)行CT檢查,以此結(jié)合核酸檢測進(jìn)一步確診。

因此有網(wǎng)友質(zhì)疑,核酸檢測這一技術(shù)在公共安全領(lǐng)域應(yīng)用的可靠性。對此,我在這里為大家梳理一下目前2019-新型冠狀病毒核酸檢測結(jié)果假陽性、假陰性的原因,以期提高檢驗同行及臨床醫(yī)生對于核酸檢驗結(jié)果保障的理解,提高核酸檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確率。


下面小編來具體分析一下原因
1、標(biāo)本采集問題
高質(zhì)量的標(biāo)本,才可能有高質(zhì)量的檢驗報告
》標(biāo)本采集采樣時機(jī)問題：
鼻拭子/咽拭子標(biāo)本：患者發(fā)病3日內(nèi),可采集鼻拭子/咽拭子標(biāo)本；
糞便標(biāo)本：如患者發(fā)病早期出現(xiàn)腹瀉癥狀,則留取糞便標(biāo)本。
》 標(biāo)本質(zhì)量問題（如采樣部位、采樣量）
》標(biāo)本存放時間過長（病毒核酸降解）,使用不合適的保護(hù)劑等都會造成假陰性。研究顯示少數(shù)患者的感染部位僅限下呼吸道,而不在鼻咽部,所以咽拭子反復(fù)檢測都是陰性,而CT顯示癥狀不斷加重的情況是存在的,建議取下呼吸道的肺泡灌洗液用來做冠狀病毒核酸檢測。
咽拭子采集樣本直接影響病毒采集量。樣本采集方法不當(dāng),有可能造成無法采集到足夠數(shù)量的口、咽部細(xì)胞,從而采集不到足夠的病毒,導(dǎo)致病毒核酸拷貝數(shù)低,因此可能出現(xiàn)檢測結(jié)果呈陰性。
  保存液問題,RNA保存液導(dǎo)致病毒顆粒沉淀,回收率降低?；虮４嬉蝴}分高,導(dǎo)致裂解液無法有效釋放病毒核酸。

2、試劑盒問題
》純化問題：影響核酸提取純化的因素包括裂解效率,中和沉淀,結(jié)合效率,洗脫效率等。同時,洗脫產(chǎn)物若含太高的鹽份或乙醇也會對后續(xù)的PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。（注1：免疫細(xì)胞含有大量RNase 或使用的耗材、緩沖液含有環(huán)境中的RNase,裂解液不能完全滅活RNase,導(dǎo)致RNase污染。注2：冠狀病毒是單鏈RNA病毒,在高濃度GuHCl或GuSCN中容易降解,不宜暴露時間過長。）

 逆轉(zhuǎn)錄酶：與Taq酶相比,逆轉(zhuǎn)錄酶相對脆弱,活性保持或獲得高活性的逆轉(zhuǎn)錄酶相對不容易。純化制品中RNase污染也是要充分考慮的因素。
》 引物探針設(shè)計局限性,病毒變異位點(diǎn)在設(shè)計位點(diǎn)上。
》陽性對照品：需要注意的是,新型冠狀病毒是RNA病毒,由于RNA的制備困難,很多公司的陽性參考品就用構(gòu)建的質(zhì)粒DNA或者PCR擴(kuò)增產(chǎn)物來替代,但是DNA不參與提取和逆轉(zhuǎn)錄的過程控制,所以不能起到嚴(yán)格意義上的陽性對照。
目前已見報道有公司申報注冊的試劑中,陽性對照品為包含Orf1ab基因、N基因、內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增序列的假病毒,可以模擬樣本中病毒核酸的原始狀態(tài),能夠準(zhǔn)確監(jiān)控提取、逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量檢測全流程。
還需要考慮到各個環(huán)節(jié)在核酸檢測中都能起到質(zhì)控的作用,對于新型冠狀病毒來說,質(zhì)粒DNA或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)控效果,只能在PCR擴(kuò)增階段起作用,所以假病毒顆粒的作用非常重要。

3、實驗室
核酸提取過程要求精細(xì)操作,對操作人員技術(shù)有較高要求。如果操作不當(dāng),可能導(dǎo)致病毒核酸降解,最終導(dǎo)致檢測結(jié)果呈陰性。新冠病毒為單鏈RNA病毒,相對于DNA,RNA極易降解。細(xì)胞內(nèi)源性RNA酶或者實驗室空間氣溶膠里所攜帶的RNA酶都可能導(dǎo)致降解。
 室內(nèi)質(zhì)控分為陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。目前,定點(diǎn)檢測醫(yī)院可以利用陽性病人標(biāo)本滅活后,或者利用提取的核酸標(biāo)本制備批量的內(nèi)部質(zhì)控品,有的實驗室已經(jīng)有制備了。而陰性質(zhì)控可以使用試劑空白和非新型冠狀病毒感染病人的樣本等。
 冠狀病毒核酸檢測室間質(zhì)評工作,這個目前還沒有開展,但這個非常重要。上海臨床檢驗中心積極推進(jìn)本項工作,目前還沒有參加的實驗室,應(yīng)該盡快參加。
 報告解讀與臨床溝通 ：實驗室進(jìn)行核酸檢驗檢測的結(jié)果,要主動與臨床醫(yī)生溝通,實驗室結(jié)果要結(jié)合病史（是否到過武漢、是否接觸過武漢發(fā)熱患者等）、影像學(xué)表現(xiàn),綜合分析；臨床醫(yī)生會結(jié)合患者的臨床癥狀、影像學(xué)、核酸檢測等結(jié)果進(jìn)行判斷。當(dāng)出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果,要尋找原因,并不斷改進(jìn)。

總結(jié)如下表：